技術(shù)交流

國家豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室劉業(yè)兵團(tuán)隊(duì)對重要人獸共患病“尼帕病毒”的檢測技術(shù)研究進(jìn)行綜述，并在中國獸藥雜志刊發(fā)，李芳韜博士為第一作者。尼帕病毒（Nipah virus, NiV）是一種人畜共患的高致病性病毒，人感染NiV后，死亡率接近40%；豬作為中間宿主，感染NiV后具有高發(fā)病率和高死亡率特點(diǎn)。近年來，NiV疫情在我國相鄰的多個(gè)東南亞國家頻繁出現(xiàn)，預(yù)示該病傳入我國風(fēng)險(xiǎn)日益增高。

近年來NiV在血清學(xué)診斷和分子學(xué)診斷技術(shù)方面的研究進(jìn)展，包括臨床常用的傳統(tǒng)技術(shù)，以及重組蛋白ELISA、Luminex、二代測序等新興診斷方法，為臨床樣本中NiV的鑒定和監(jiān)測方法更新?lián)Q代提供參考，對監(jiān)測NiV從國外的傳入情況、防控豬群NiV疫情發(fā)生以及守護(hù)公共衛(wèi)生安全具有重大意義。

NiV血清學(xué)傳統(tǒng)診斷方法主要包括ELISA和血清中和試驗(yàn)，常用靶標(biāo)為NiV的F蛋白、G蛋白和N蛋白。其中，血清中和試驗(yàn)需要在生物安全四級實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，是NiV實(shí)驗(yàn)室診斷的“黃金”標(biāo)準(zhǔn)；ELISA是一種安全性好、敏感性高、特異性強(qiáng)和經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的診斷工具，可用于臨床樣本的大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查和持續(xù)監(jiān)測。目前，檢測NiV常用ELISA方法包括捕獲ELISA檢測IgM抗體和間接ELISA檢測IgG抗體。以往研究表明，第一代間接ELISA結(jié)果存在非特異性反應(yīng)，須由在生物安全四級實(shí)驗(yàn)室中操作的血清中和試驗(yàn)進(jìn)一步確定ELISA結(jié)果，使NiV陽性樣本的篩選不具有普適性。因此，開發(fā)和評價(jià)用于篩查NiV疑似病例的ELISA新方法，有助于監(jiān)測豬群NiV疫情以及制定公共衛(wèi)生預(yù)防措施。隨著診斷技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，近些年來逐漸研發(fā)出更多適用于NiV疫情監(jiān)測的新方法，對于新技術(shù)的開發(fā)使現(xiàn)有的血清學(xué)分析得以改進(jìn)，主要包括以下技術(shù)：

1.1 基于重組蛋白的ELISA鑒別方法

由于NiV具有高度危險(xiǎn)性，利用重組蛋白代替全病毒作為ELISA檢測抗原，可適用于臨床樣本的流行病學(xué)調(diào)查。NiV的G蛋白和N蛋白可以用于建立NiV間接ELISA檢測方法，進(jìn)行陽性血清的篩選以及NiV與亨德拉病毒(HendraVirus,HeV)的鑒別診斷。使用不同的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)HeV和NiV截短形式的G蛋白以及NiV的全長N蛋白，以這些重組蛋白為基礎(chǔ)，采用ELISA檢測豬血清中HeV或NiV特異性抗體,以達(dá)到鑒定NIV或HeV目的。因?yàn)镠eV和NiV的交叉反應(yīng)性，可以通過使用基于全長N蛋白的ELISA對血清進(jìn)行初篩，然后再用基于截短G蛋白的ELISA區(qū)分HeV和NiV感染。但是HeV和NiV均屬亨德拉尼帕病毒屬，抗原之間密切相關(guān)，為了排除交叉反應(yīng)與假陽性現(xiàn)象，仍需進(jìn)行血清中和試驗(yàn)才能確認(rèn)為NiV陽性。

1.2 基于NiV-g蛋白多克隆抗體的抗原捕獲夾心ELISA

采用基于NiV-g蛋白多克隆抗體的抗原捕獲夾心ELISA方法，可以用于檢測咽拭子、鼻拭子、腦脊液、尿液和血液中的NiV感染。經(jīng)研究表明，該方法能夠更快速地診斷常規(guī)PCR方法無法檢測到的新型NiV。雖然PCR是診斷NiV感染最敏感的技術(shù)，但當(dāng)病毒變異后，可能會造成PCR鑒定方法失效。因此，這種基于NiV-g蛋白多克隆抗體的抗原捕獲夾心ELISA方法可以在血清學(xué)層面鑒定到新型NiV感染，補(bǔ)充傳統(tǒng)血清學(xué)方法和PCR方法在檢測過程中可能遺漏的陽性病例。

1.3 Luminex測定抗體法血清學(xué)診斷方法

除了傳統(tǒng)的ELISA和血清中和試驗(yàn)診斷方法，還有一種Luminex測定法已開發(fā)用于NiV的血清學(xué)檢測，包括設(shè)計(jì)用于抗體檢測和鑒別的Luminex結(jié)合測定法，以及設(shè)計(jì)用于病毒中和的Luminex阻斷測定法。該技術(shù)通過在不同熒光編碼的微球上進(jìn)行抗原－抗體結(jié)合反應(yīng)，運(yùn)用激光分別檢測微球編碼和報(bào)告熒光來達(dá)到定性和定量的目的，一個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)可以完成多種不同的生物學(xué)反應(yīng)，可同時(shí)檢測上百種生物靶標(biāo)，并且在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成檢測。通過對臨床樣本的篩選結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)合測定法和阻斷測定法可以替代傳統(tǒng)的ELISA和血清中和試驗(yàn)。因此，Luminex測定法是一種快速、靈敏、特異的檢測臨床樣本血清中NiV的有效替代方法。并且該方法不需要在活細(xì)胞上培養(yǎng)病毒，無需在生物安全四級實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，適用于臨床疾病診斷和流行病學(xué)監(jiān)測可能需要的大批量操作條件。

ELISA可以用來準(zhǔn)確測定大批量生物樣品，但傳統(tǒng)ELISA只能分析一個(gè)目標(biāo)分子，不具備同時(shí)分析多種目標(biāo)分子的能力。在ELISA基礎(chǔ)上發(fā)展的Luminex測定法不僅可以替代傳統(tǒng)方法，還可以在一次實(shí)驗(yàn)中完成對多種目標(biāo)分子的分析，從而建立了更加高效、快速的分析平臺。

1.4 基于假病毒的中和試驗(yàn)

由于NiV中和試驗(yàn)不具有普適性，因此可以通過構(gòu)建NiV假病毒，設(shè)計(jì)基于假病毒的NiV中和試驗(yàn)。已有研究通過基因重組技術(shù)構(gòu)建了單獨(dú)表達(dá)F或G蛋白的重組水泡性口炎病毒作為已知抗原，并在此基礎(chǔ)上建立了檢測NiV抗體的空斑抑制試驗(yàn)；或利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了共表達(dá)F、G蛋白與綠色熒光蛋白(GFP)的重組水泡性口炎病毒，作為已知病毒抗原檢測NiV血清樣本。上述表達(dá)綠色熒光蛋白或熒光素酶的NiV假病毒被稱為第一代假病毒。在檢測過程中，基于NiV第一代假病毒的中和試驗(yàn)仍需要特定的檢測設(shè)備以檢測熒光蛋白或熒光素酶。所以，在上述假病毒的基礎(chǔ)上，NiV第二代假病毒采用表達(dá)分泌型堿性磷酸酶的水泡性口炎病毒模型重組F和G蛋白，通過使用ELISA酶標(biāo)儀測量上清液中的分泌型堿性磷酸酶活性，從而開發(fā)出一種新型的基于NiV假病毒的血清中和試驗(yàn)檢測方法，其結(jié)果與傳統(tǒng)的活體NiV試驗(yàn)獲得的抗體檢測結(jié)果一致。

分子學(xué)診斷方法主要包括一系列針對病毒核酸的檢測方法，除了傳統(tǒng)PCR方法外，還有實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)、多重PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR和雙重套式RT-PCR等方法，以及多種核酸測序方法。在臨床上，通過采集腦、肺、脾臟或淋巴結(jié)等組織，可用于NiV的初篩及進(jìn)一步鑒定。針對NiV的M、N和P基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物監(jiān)測疑似NiV感染樣本，常用于東南亞地區(qū)爆發(fā)NiV疫情時(shí)的病毒鑒定。其中，qRT-PCR作為目前應(yīng)用最為普遍的分子學(xué)診斷方法,已被證明比傳統(tǒng)PCR靈敏1000倍，因此在多次疫情爆發(fā)時(shí)使用,其批間和批內(nèi)差異小、重復(fù)性好、操作簡單、安全、快速，已成為病原分子診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。除了PCR方法外，還有更多新興分子學(xué)方法可以用于NiV診斷，主要包括以下技術(shù)：

2.1Luminex測定核酸法Luminex測定法

除了可以應(yīng)用于NiV的血清學(xué)檢測，還可以應(yīng)用于NiV的核酸檢測，對HeV和NiV分離株進(jìn)行檢測和鑒別，并且檢測靈敏度與qPCR相當(dāng)。已有研究通過利用低聚標(biāo)記微球構(gòu)建了用于HeV和NiV檢測和鑒別的多重鑒定方法，針對N蛋白和P蛋白編碼基因的多個(gè)位點(diǎn)構(gòu)建Luminex測定法，使微球懸浮陣列系統(tǒng)能夠在一次反應(yīng)中同時(shí)識別多個(gè)核苷酸靶標(biāo)，其結(jié)果與已有的qPCR相比，Luminex測定法可明確鑒別HeV和NiV感染病例，并且HeV檢測的敏感性與qPCR相當(dāng)，具有較高的分析和診斷特異性和敏感性。

2.2二代測序

基于PCR結(jié)果的一代測序在過去NiV的發(fā)現(xiàn)和診斷中起關(guān)鍵作用，對NiV擴(kuò)增產(chǎn)物的測序可以進(jìn)一步證實(shí)檢測結(jié)果，并且對研究病毒基因突變和病毒基因演化方面具有重要作用。隨著二代測序的普遍應(yīng)用，相比于一代測序大幅降低了經(jīng)濟(jì)成本，并且在保持測序準(zhǔn)確性的同時(shí)，大幅降低了測序時(shí)間。利用二代測序從初篩陽性的樣本中獲取NiV全長基因組，以及鑒定新型NiV毒株，是目前最快捷、有效的診斷與分析流程。

隨著技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，具有巨大測序深度的高通量測序，在排除大量宿主及環(huán)境背景信息的干擾后能夠檢測到較小基因組的病毒，可以不進(jìn)行PCR步驟、直接在臨床和環(huán)境樣本中檢測NiV核酸，為更加直接、精確地從樣本中鑒定NiV基因信息提供了技術(shù)支持。該深度測序診斷方法設(shè)計(jì)了基于生物素化RNA誘餌原理的病毒富集板，能夠特異性捕獲并富集宏基因組中的病毒信號，可顯著提高檢測背景信息復(fù)雜臨床樣品的敏感性，對于感染多種病原的樣本，能夠同時(shí)檢測到不同種病原的遺傳信息。

血清中和試驗(yàn)雖然是NiV實(shí)驗(yàn)室診斷的“黃金”標(biāo)準(zhǔn)，但是在臨床采樣檢測和攻毒實(shí)驗(yàn)中，血清中和試驗(yàn)的檢測陽性率低于qRT-PCR和ELISA檢測陽性率。ELISA試驗(yàn)作為普遍應(yīng)用的血清學(xué)檢測方法，無需在生物安全四級實(shí)驗(yàn)室中即可進(jìn)行檢測；然而，其敏感性和特異性略低于分子檢測技術(shù)，如RT-PCR、qRT-PCR和其他分子生物學(xué)方法，無法快速、敏感和特異性地檢測到NiV。在NiV疫情再次爆發(fā)時(shí)，PCR方法和基因組測序結(jié)果對于NiV的遺傳學(xué)分析和分子特征研究是必不可少的，但是由于引物靶向序列的局限性，PCR診斷方法無法適應(yīng)病毒的快速變異，可能會造成PCR鑒定方法失效。因此，只有將多種檢測方法相結(jié)合，才能更加快速、高效地診斷NiV,對防控豬群NiV疫情發(fā)生、監(jiān)測NiV從國外的傳入情況以及守護(hù)公共衛(wèi)生安全具有重大意義。

在目前的研究中，為了更精確的篩查臨床樣本中的NiV陽性病例，可先采用qRT-PCR方法初步篩選大量臨床樣本中的陽性樣本，再采用ELISA方法對陽性樣本的血清抗體進(jìn)行進(jìn)一步篩選及確認(rèn)，最后利用二代測序(NGS)對組織和拭子樣本進(jìn)行NiV的全基因組測序。隨著NiV假病毒相關(guān)研究的進(jìn)一步發(fā)展，NiV的血清中和試驗(yàn)無需在生物安全四級實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，使血清中和試驗(yàn)作為NiV實(shí)驗(yàn)室診斷的“黃金”標(biāo)準(zhǔn)有望在日后進(jìn)一步推廣；而具有巨大測序深度的高通量測序，能夠排除大量宿主及環(huán)境背景信息的干擾，并且可以不進(jìn)行PCR步驟、直接在臨床和環(huán)境樣本中檢測NiV核酸，為更加直接、精確地從樣本中鑒定NiV基因信息提供了技術(shù)支持，也有利于NiV檢測進(jìn)一步從實(shí)驗(yàn)室推廣到臨床。

NiV的高發(fā)病率和高死亡率，對養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了重大威脅。目前，通過臨床癥狀難以鑒別NiV與豬群中長期存在的呼吸道癥狀為主要表征的病毒，為臨床診斷NiV造成了巨大困難。所以，在發(fā)展實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的同時(shí)，應(yīng)進(jìn)一步簡化操作步驟，發(fā)展易于臨床操作的快速診斷分析技術(shù)，以降低我國NiV流行的潛在風(fēng)險(xiǎn)，防控該病的輸入與爆發(fā)。